Схема исследования на холеру · GitHub

Бактериологическое исследование при холере

РКГП «ЗАПАДНО-КАЗАХСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ университет ИМЕНИ МАРАТА ОСПАНОВА»

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ СТУДЕНТА

Специальность: «Общая медицина»

Дисциплина: Микробиология

Кафедра: микробиологии, вирусологии, иммунологии

Курс: второй

Тема №4: «Патогенные и условно патогенные вибрионы. Кампилобактерии,

хеликобактерии, иерсинии».

ВН.СРС:«Клебсиеллы. Патогенность. Этиологическая и патогенетическая роль.

Экология. Роль во внутрибольничных инфекциях. Лабораторная диагностика.

Профилактика и лечение» (реферат).

Составитель: к.м.н., доцент

____________ Жарасов М.Ж..

Методические рекомендации для преподавателей 2 курса факультета

«Общая медицина»к практическому занятию№ 4

Тема: «Патогенные и условно патогенные вибрионы. Кампилобактерии,

хеликобактерии, иерсинии».

ВН.СРС:«Клебсиеллы. Патогенность. Этиологическая и патогенетическая роль.

Экология. Роль во внутрибольничных инфекциях. Лабораторная диагностика.

Профилактика и лечение» (реферат).

Практического занятия и ориентировочный расчет времени

Микробиологическая диагностика холеры

Холера — особо опасное, карантинное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae биоваров cholerae и eltor, проявляющееся в виде острого гастроэнтерита с выраженной интоксикацией и обезвоживанием (эксикозом) в результате нарушения водно-электро­литного обмена, cвязанного с выработкой вибрионами холерного энтеротоксина (холерогена).

Основной метод лабораторной диагностики холеры – бактериологический.

При выполнении исследований на холеру необходимо строго соблюдать требования противоэпидемического режима. Материал для исследования на холеру собирают в стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов, упаковывают и достав­ляют в лабораторию. Банки, пробирки должны быть герметично закрыты водонепроницаемыми пробками, которые заливают парафином, посуду обвязывают двойным слоем вощеной бумаги и обрабатывают дезинфицирующим раствором. В направ­лении указывают фамилию, инициалы, возраст больного, его домашний и служебный адрес, диагноз, даты начала болезни и госпитализации, дату и час взятия материала, а также фамилию и инициалы лица, направившего анализ. Банки и пробирки с материалом для исследования перекладывают ватой, помещают, в металлическую коробку, а затем в деревянный ящик, который пломбируют, надписывают «Верх, осторожно» и на служебном транспорте с сопровождающим лицом пересы­лают в лабораторию в течение 2 часов после взятия проб.

Исследования на холеру проводятся круглосуточно в специальной лаборатории медицинскими работниками, прошедшими подготовку по особо-опасным инфекциям. Методы, применяемые для микробиологической диагностики холеры, представлены в схеме 13.

Микроскопический метод (микроскопия окра­шенных мазков и препаратов «висячей капли» из мате­риала от больного) при холере в настоящее время не применяется в связи с низкой его информативностью. Разработаны методы экспресс-диагностики холеры (РИФ).

Бактериологический метод состоит из нескольких этапов.

Первый этап. Исследуемый материал засевают на щелочные (элективные) плотные питательные среды (щелочной агар Монсура – МПА с триптиказой, хлоридом на­трия, таурохолатом натрия, карбонатом натрия; TCBS — тиосульфат-цитрат-бромтимол-сахарозный агар;ще­лочной МПА) и жидкие среды обогащения (1% щелочная пептонная вода).

Второй этап проводится через 6 —8 ч от начала анализа. Выполняют пересев из верхней части 1-й среды накопления на плотные элективные питательные среды и на 2-ю среду накопления. При наличии на 1-й пептонной воде нежной голубоватой пленки из нее готовят мазок в окраске по Граму, в котором обнаруживают грамотрицательные изогнутые в виде «запятой» вибрионы, проверяют подвижность, ставят ОРА с холерны­ми сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.

Третий этап выполняется через 12— 14 ч от начала анализа. Производится пересев из верхней части 2-й среды накопления на плотные элективные питательные среды. Изучают и отбирают для исследования типичные для холерного вибриона колонии на плотных средах, засеянных нативным материалом.

Схема 13.Микробиологическая диагностика холеры

Четвертый этап. (через 18-24 ч от начала анализа). Изучают и отбирают с помощью стереомикроскопа типичные для холерного вибриона колонии на всех плотных средах. Хо­лерный вибрион образует прозрачные, круглые, диаметром 1-2 мм, гладкие, пло­ские, го­могенные, с ровными краями колонии, имеющие голубоватый оттенок и маслянистую кон­систенцию. На агаре TCBSколонии холерного вибриона ярко-желтые на зеленом фоне среды, на сре­де Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром. Колонии проверяют на наличие оксидазы (холерные вибрионы оксидазоположительны), ставят РА на стекле с холерны­ми сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.

Читайте также:  Постоянная изжога, причины что делать, частые приступы жжения

Положительная РА или ИФМ в сочета­нии с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры позволяет вы­дать предварительный положительный ответ.

Пятый этап проводится через 24 —36 ч от начала исследования. На этом этапе изучают и отбирают характерные для холерного вибриона культуры на среде Ресселя, на которой холерный вибрион расщепляет сахарозу, что сопровождается покраснением среды в столбике без образования газа, но не ферментирует лактозу (отсутствие изменений скошенной части среды). Со среды Ресселя готовят мазки в окраске по Граму с целью обнаружения характерных по морфологическим свойствам вибрионов, проверяют наличие подвижности и оксидазы, ставят РА с холерными сыворотками (О-1, RO,Огава, Инаба, при отрицательном результате — с сывороткой О-139) и при наличии положительных результатов выдают ответ о выделении соответствующего холерного вибриона.

Окончательную идентификацию оксидазопопожительных культур проводят, используя сокращенную или полную схемы (табл. 15).

Таблица 15. Дифференциация холерных вибрионов

Тесты V.cholerae asiaticae V.cholerae el-tor НАГ
Агглютинация О-сывороткой + +
Агглютинация сыворотками Инаба и Огава + +
Лизис фагами: Холерный фаг С (фаг IV) Фаг Эль-Тор + — — + + +
Агглютинация куриных эритроцитов + +
Гемолиз эритроцитов барана + +
Рост на среде с полимиксином + +
Гексаминовый тест + +
Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) + +

Сокращенная схема предполагает постановку развернутой РА с сыворотками Инаба и Огава, пробы с диагностическими холерными фагами, определение ферментативной группы по Хейбергу. Полная схема дополнительно включает тесты для дифференциации биоваров холерного вибриона (классического и Эль-Тор), в частности, определение гемагглютинирующих и гемолитических свойств, чувствительности к полимиксину, способности давать положительную реакцию Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола — ацетоина из глюкозы). Ацетоин определяют добавлением в культуру, выращенную на глюкозо-фосфатном бульоне Кларка, 5% α-нафтола и 40%-го гидроксида калия; при встряхивании пробирок среда окрашивается в розовый или рубиново-красный цвет.

Для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов и их дифференциации от холероподобных и нехолероподобных вибрионов используют систему индикаторных бумажных дисков (СИБ), в состав которой входят тесты на оксидазу, индол, ферментацию лактозы, глюкозы, саха­розы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита, аргинина, лизи­на и орнитина.

Шестой этап (выполняется через 36-48 ч от начала анализа) — окончательная идентификация выделенных куль­тур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа о выделении холерного вибриона с указанием биовара, серогруппы (серовара) и эпидемической значимости по косвенным биологическим признакам (гемолитической активности, группе Хейберга и др.). Типичные куль­туры Vibrio cholerae представляют собой грамотрицательные изо­гнутые в виде запятой или прямые полиморфные активно подвижные палочки, обладающие оксидазой, разлагающие глюкозу с образованием кислоты без газа, декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не ферментирующие аргинин, принадлежа­щие к 1-й (реже 2-й) группе Хейберга, агглютинирующиеся хо­лерными сыворотками и лизирующиеся диагностическими фагами. Если выделенная культура не агглютинируется сыворотками к О1 и О139, ее относят к группе НАГ-вибрионов, а при наличии соответствующих сывороток определяют ее принадлежность к другой серогруппе. Токсигенные штаммы холерных вибрионов серогрупп Ои О139 обычно не лизируют бараньи эритроциты, относятся к 1-й группе Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу, но не арабинозу), лизируются определенными фагами в комплексном методе с применением ХДФ.

Вирулентность холерных вибрионов определяют в специализированных лабораториях путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков, а также методами генодиагностики (ПЦР или ДНК-ДНК-гибридизация с целью определения гена, ответственного за выработку токсина).

Серодиагностика являет­ся дополнительным методом лабораторной диагностики холеры. Исследуют пар­ные сыворотки крови больных, взятые с интервалом в 6-8 дней, с целью выявления агг­лютининов с помощью РА (диагностический титр 1:40 и выше), антитоксинов с помощью РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (диагностический титр — 1: 160) и вибриоцидных антител с помощью реакции иммобилизации вибрионов (диагностический титр1:1000). Учитывается также нарастание титра антител (не менее чем в 4 раза) в процессе инфекции.

Читайте также:  Мокрота с кровью при кашле – возможные причины

Экспресс-диагностика — прямая и непрямая РИФ с использованием специфических О-холерных сывороток серогрупп 01 и 0139, меченых изотиоцианатом флюоресцеина; РНГА со специфическими иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами. Ставят также реакцию иммобилизации вибрионов с теми же сыворотками (2 капли материала наносят на предметное стекло, в одну из них вносят каплю сыворотки О1 или О139 в разведении 1: 100, в другую каплю ФР — контроль). Готовят препараты «раздавленной» капли, которые исследуют с помощью темнопольного, фазово-контрастного или обычного микроскопа с опущенным конденсором при увеличении 400 — 600. Положительная реакция характеризуется по­терей подвижности вибрионов и их склеиванием.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный микропрепарат холерного вибриона V.cholerae, окрашенный по Граму. Холерный вибрион — грамотрицательная изогнутая палочка.

2. Бактериологический метод. Ознакомиться с ос­новными биологическими свойствами классического биовара холерного вибриона и биовара Эль-Тор:

· фаголизабельность. Классический холерный вибрион лизируется фагом С и нечувствителен к действию фага Эль-Тор II. Вибрион Эль-Тор лизируется фагом Эль-Тop и нечувствителен к фагу С (демонстрация);

· чувствительность к полимиксину. Учесть рост классического холерного вибриона и вибриона Зль-Тор на среде с добавле­нием полимиксина. Вибрион Эль-Тор к полимиксину не чувствителен, классический холерный вибрион – чувствителен;

· гемолитические свойства. Вибрион Эль-Тор лизирует эритроциты; классический холерный вибрион, как правило, нет (демонстрация);

· определение серовара холерного вибриона. Учесть разверну­тую реакцию агглютинации c сыворотками Инаба и Огава (демонстрация).

3. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры:

· люминесцирующая хо­лерная сыворотка для постановки реакции иммунофлюоресценции с целью выявления вибрионов;

· агглютинирующие холерные сыворотки Инаба и Огава (для постановки реакции агглютинации при идентифика­ции холерного вибриона);

· холерные фаги: классический (фаг С) и Эль-Тор. Использу­ются для фагодиагностики;

· поливалентный холерный бактериофаг для лечения и профилактики;

· холерная вакцина. Создано 3 вакцины против холеры (убитая Эль-Тор; холероген- анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона для подкожных инъекций; холероген-анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона таблетированный). Используются для специфи­ческой профилактики холеры.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

МАТЕРИАЛ ДЛЯИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения боль­ного, рвотные массы, вода, пищевые продукты; при постмор-тальной диагностике: отрезки тонкой кишки и желчный пу­зырь с частью печени. При необходимости хранения материал

помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор сглицерином). Для длительного сохранения рекомендуется по­лоску фильтровальной бумаги, смоченную в жидких испраж­нениях, поместить в герметически закрытый пластиковый кон­тейнер — для предохранения от высыхания. Таким образом возбудитель сохраняется в материале до 5 нед.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Бактериоскопическое исследование.Из исследуемого мате­риала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и вод­ным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в котором определяют наличие по­движных вибрионов при темнопольной или фазово-контраст-ной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активно-подвижных вибрионов в препарате «ви­сячая» капля позволяет дать первый предварительный положи­тельный ответ (рис. 13.3.1; на вклейке).

Бактериологическое исследование.Материал засевают в раз­личные жидкие и плотные элективные среды, в частности во флаконы со щелочной пептонной водой (1 % с теллуритом) и на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пеп­тонной воде инкубируют при 37 «С в течение 5—6 ч, на чаш­ках — 10—12 ч. Из голубоватой пленки, образующейся на пеп­тонной воде, или из ее поверхностного слоя делают мазки и препараты «раздавленная» и «висячая» капля. Этот же мате­риал используют для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохолерной 01-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для по­становки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют туда же несколько капель серной кислоты. В положительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозоиндола под влиянием холерного вибриона. Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептон-ную воду. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютини­рующихся 01-сывороткой, позволяет дать второй предвари­тельный ответ. Независимо от полученных результатов продол­жают исследование, как показано на схеме 13.3.1.

Читайте также:  Боль в пятке – причины и лечение KinesioPro

Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5—6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию аг­глютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого агглютинирующую 01-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3—4-часо­вой инкубации при 37 «С.

Идентификацию культуры проводят на основании опреде-

Схема 13.3.1. Микробиологическое исследование при холере

ления чувствительности вибрионов к холерному фагу, агглю-тинабельности противохолерной 01-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и Огава, их гемоли­тических и биохимических свойств (оксидазная активность декарбоксилазы аминокислот, ферментация углеводов, образо­вание ацетилметилкарбинола и др.).

Реакция Фогеса —Проскауэра: вибрионы выращива­ют в глюкозофосфатном бульоне, затем добавляют реактив аль-

фа-нафтол в растворе щелочи; при наличии ацетилметилкар­бинола наблюдается рубиново-красное окрашивание среды.

Гексаминовый тест: культуру выращивают на бульоне с глюкозой, гексамином (уротропином) и индикатором бромти-моловым синим. В положительном случае через 6—8 ч наблю­дается изменение зеленого цвета среды в желтый.

Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавливают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных вибрионов в реак­ции агглютинации с 01-сывороткой, по чувствительности к специфическому фагу и другими тестами; 3) определяют видо­вые признаки культур. Окончательное заключение о вьщелении и дифференцировании холерных вибрионов дают через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических признаков возбудителя (табл. 13.3.1).

Таблица 13.3.1. Тесты для дифференциации V.cholerae

Тест V.cholerae asiatici V.cholerae el-tor Неагглюти- нирующиеся вибрионы
+ +

Агглютинация типовыми сы- +

воротками Огава и Инаба Лизис фагами:

холерный фаг С (фаг IV) +

Агглютинация куриных эрит- —

Гемолиз эритроцитов барана —

Рост на агаре с 50 ЕД поли- —

Трудности при оценке результатов бактериологического ис­следования встречаются при выделении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не агглютинирующихся холерной 01-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут лизиро-ваться одним из специфических холерных фагов и обладать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами.

Экспресс-методы диагностики: иммобилизация вибри­онов холерными сыворотками и типовыми холер­ными фагами. Капли испражнений или материала с поверх­ности пептонной воды обрабатывают холерной 01-сыворот-

кой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты «раздавленная» капля, которые исследуют с помощью темнопольной и фазо-во-контрастной микроскопии. В положительном случае через 3—5 мин движение вибрионов прекращается.

Иммунохимические исследования. Применяют ме­тод прямой ИФ. Мазки из исследуемого материала обрабаты­вают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и ис­следуют в люминесцентном микроскопе. Положительным ре­зультатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестя­щего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10 6 клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя спомощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих моле­кул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Выявление антител к возбудителю являет­ся вспомогательным и применяется для ретроспективной диа­гностики холеры, выявления вибрионосителей и оценки напря­женности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РИГА, диагностический титр антител в этих реакциях 1:80—1:320, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса.

Диагностика носительства

Во время вспышки холеры проводят массовое обследование на носительство V.cholerae.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ректальные мазки (фекалии, взятые тампоном из прямой кишки).

Бактериологическое исследование.Посев материала от 10 обследуемых на обогатительную среду с 01-агглютинирующей диагностической сывороткой. В положительных случаях через 3—4 ч начинается выпадение хлопьев в результате агглютина­ции размножившихся вибрионов. При обнаружении в осадке грамотрицательных подвижных вибрионов каждый из 10 паци­ентов обследуется индивидуально.

Ссылка на основную публикацию
Суставы запястья — Все о суставах
Из чего образован межфаланговый сустав? Анатомия — наука, изучающая строение тела человека, которая включает такой раздел как артрология. В данном...
Студопедия — АППЕНДЭКТОМИЯ
Аппендэктомия по волковичу дьяконову ход операции Аппендэктомия. Операции при аппендиците. Как удаляется червеобразный отросток? Доступ при аппендэктомии. Как правило, используется...
Студопедия — Биосинтез ТАГ
Биосинтез ТАГ В почках, стенке кишечника, печени высока активность глицеролкиназы.В мышцах, жировой ткани активность глицеролкиназы низкая и образование глицерол-3-фосфата связано...
Суставы человека строение, классификация, анатомия
Характеристика суставов человека Вопросы для повторения. 1. Какие суставы называют простыми? 2. Какие суставы называют сложными? 3. Какие суставы называют...
Adblock detector