Электрофорез метод изучения клеток 1

Протеомика

Нашей лабораторией ведется исследование белков клеточных стенок растительных клеток методами протеомики. Особое внимание в наших исследованиях уделено вторичной клеточной стенке желатинозного типа, которую формируют исключительно растительные волокна, и сравнительному анализу протеома вторичной клеточной стенки ксиланового и желатинозного типа. В качестве модельных систем нами выбраны растения, ткани которых формируют клеточные стенки и ксиланового типа и желатинозного. Такими модельными системами служат растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) и конопли (Cannabis sativa L.), в которых клетки ксилемы формируют вторичную клеточную стенку ксиланового типа, а флоэмные волокна – вторичную клеточную стенку желатинозного типа. Это позволяет сравнивать белки, характерные для того или иного типа клеточных стенок, сформированных в одних и тех же условиях окружающей среды, на одной стадии развития растения.

Протеомика клеточных стенок столкнулась с рядом трудностей, связанных как с самой структурой клеточных стенок, так и с природой клеточно-стеночных белков, что усложнило процедуру их экстракции, разделения и дальнейшей идентификации. Клеточная стенки не окружена мембраной, как большинство других субклеточных компартментов, что делает особенно вероятными и потери белков, и попадание во фракцию чужеродных полипептидов. Особенно это касается щелочных белков, которые могут ионно взаимодействовать с уроновыми кислотами пектиновых веществ. Именно такое взаимодействие характерно для многих канонических белков клеточной стенки: из них более 60% имеют pI в диапазоне от 8.0 до 12.9 (Jamet et al., 2006). Таким образом, необходимо тщательно отрабатывать методы выделения клеточной стенки, использовать адекватные контроли и альтернативные подходы для локализации белка. Тем не менее, несмотря на трудности, протеомика клеточных стенок стала активно развивающимся направлением в современной клеточной биологии (Boudart et al., 2007).

  1. экстракция белков клеточной стенки;
  2. разделение клеточно-стеночных белков с помощью одномерного / двумерного электрофореза или жидкостной хроматографии;
  3. идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза.

1. Экстракция белков клеточной стенки.

Наиболее оригинальная часть связана с разработкой метода выделения изолированных флоэмных волокон льна и последующей экстракцией из них белков клеточной стенки. Флоэмные волокна льна (Linum usitatissimum L.) являются уникальной моделью для установления общих закономерностей биогенеза растительной клетки с использованием разноплановых подходов, в том числе функциональной геномики и протеомики. Волокно как модельная система позволяет избежать ряд трудностей, связанных с гетерогенностью растительного образца. Так, на стадии формирования вторичной клеточной стенки волокна можно отделить от окружающих тканей с помощью отмывки в этаноле после лиофилизации (рис. 1). Это дает возможность изучения протеома определенного типа клеток на определенной стадии их развития, а также и отдельных субклеточных структур. Расположенные вдоль всего стебля волокна собраны в пучки, что облегчает их обнаружение и выделение, делая возможным проведение исследований на уровне однотипных клеток.

Рис. 1. Получение изолированного волокна.

Обособленность отдельных стадий биогенеза волокна, а также наличие так называемой «точки слома» – морфологического индикатора перехода волокон от удлинения клетки к утолщению стенки, позволяют изучать специфичные для стадий процессы. Уникальность флоэмного волокна льна проявляется также в слабой лигнификации вторичной клеточной стенки, что облегчает экстракцию составляющих ее полимеров. Чтобы получить волокна, активно формирующие вторичную клеточную стенку, участки стебля ниже «точки слома» разделяли на флоэмную и ксилемную части. На этом участке стебля волокна имеют толстую вторичную клеточную стенку, пучки волокон легко отделяются со слоем коровой паренхимы и эпидермисом, причем разделение происходит по внутренней стороне пучка. Эпидермис и большая часть паренхимных клеток удаляется при тщательном отмывании ткани.

Читайте также:  Срочно! Работа Санитарка инфекционного отделения в Москве

В нашей работе исследовались экстрагируемые солями белки, которые относятся к слабо связанным белкам клеточной стенки. Выделение клеточной стенки и экстракцию белков проводили согласно протоколу, разработанному Л. Фейз с соавторами (Feiz et al., 2006), с некоторыми модификациями. Схема эксперимента: изолированные волокна тщательно размельчали в жидком азоте. Далее проводили:

  1. гомогенизацию и последовательное центрифугирование в растворах с высокой плотностью сахарозы (0.4 М, 0.6 М и 1.0 М) в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6;
  2. интенсивную отмывку осадка 5 мМ ацетатном буфером, рН 4.6 (не менее 2 л на 8 г сырой ткани);
  3. Белки экстрагировали последовательно 0.2 М CaCl2 и 2.0 М LiCl (в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6 с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (Sigma, США));
  4. Полученный супернатант обессоливали на G-25 (15 х 50 мм, GE Health Care, Sweden, Supelco, USA);
  5. Белки осаждали 80% ацетоном в течение ночи при -20ºC.

2. Разделение клеточно-стеночных белков. Для разделения белков использовали одномерный электрофорез (1D-электрофорез), т.к., согласно данным литературы, технология двумерного электрофореза менее эффективна для разделения белков клеточной стенки. Причем более обогащена белками фракция, экстрагируемая 0.2 М CaCl2, именно эта соль считается самой эффективной для извлечения клеточно-стеночных белков из высших растений (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма клеточно-стеночных белков ксилемной части стебля льна и флоэмных волокон, экстрагируемые солями.

3. Идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза Для трипсинолиза с последующим получением масс-спектров (на базе Центра Коллективного Пользования ИБМХ) вырезали из геля белковые полосы. В каждом образце присутствовали пептиды нескольких белков, что делало получаемый спектр более сложным и, вероятно, отразилось на эффективности идентификации. Полученные для всех образцов пептидные спектры помещали в поисковую программу Mascot. Для идентификации белков по поиску гомологичных пептидных масс (Peptide Mass FingerPrint) отбирали только качественные спектры: учитывали наличие трипсиновых фрагментов, количество пептидов и интенсивность сигналов. Для идентификации белков использовали базу данных NCBInr и SwissProt. Для установления принадлежности обнаруженного белка к клеточной стенке аминокислотную последовательность (из базы данных NCBInr и Swissprot), проверяли на наличие сигнального пептида, ответственного за экстраклеточный транспорт, с помощью программ TargetP и SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP, www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), а также Phobius (http://phobius.sbc.su.se/), PS-Scan (http://expasy.org/prosite). Для установления субклеточной локализации белка помимо TargetP использовали также программы Psort (http://wolfpsort.org/), Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html). Те белки, которые согласно этим программам были идентифицированы как экстраклеточные, дополнительно проверяли на наличие трансмемебранного домена с помощью программы TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) , а также концевых последовательностей аминокислот KDEL и HDEL, ответственных за удержание белка в эндомембранной системе. Принадлежность к неклассическим белкам внеклеточного матрикса устанавливали при помощи программы SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP-1.0).

Читайте также:  Контрактубекс от морщин под глазами и на лице отзывы покупателей

С помощью целого комплекса подходов, включая методы протеомики, нами был охарактеризован индивидуальный белок клеточной стенки – бета-галактозидаза; для характеристики использовали методы хроматографии, электрофорез, электроэлюцию, иммуноферментный анализ, иммуноцитохимию, ПЦР в реальном времени, масс-спектрометрию. Это позволило в полной мере охарактеризовать белок, выявить его активность, выявить и оценить экспрессию гена данного белка, обнаружить продукты реакции исследуемого фермента:

Roach M.J., Mokshina N.Y., Snegireva A.V., Hobson N., Deyholos M.K., Gorshkova T.A. Development of Cellulosic Secondary Walls in Flax Fibers Requires beta-Galactosidase // Plant Physiology. 2011. V.156. P. 1351-1363.

Мокшина Н.Е., Ибрагимова Н.Н., Сальников В.В., Аменицкий С.И., Горшкова Т.А. Галактозидаза растительных волокон с клеточной стенкой желатинозного типа: идентификация и локализация // Физиология растений. 2012. Т.59. №2 (в печати).

Методы исследования химической организации клетки

Люминесцентная микроскопия.

Индукция с помощью ультрафиолетового света флуоресценции химических компонентов клетки (естественных или введенных извне).

Применяется для прижизненного выявления в клетке биохимических компонентов, способных к флуоресценции — витаминов, пигментов, гормонов, антибиотиков. Кроме того, с помощью синтетических флуорохромов, специфически взаимодействующих с определенными химическими компонентами клетки (ДНК, РНК, липидами и др.), исследуют их внутриклеточную локализацию.

Дифференциальное центрифугирование.

Центрифугирование смеси, полученной в результате разрушения клеток (ткани, органа), в специальных центрифугах при различных скоростях вращения ротора, что позволяет раздельно осаждать частицы с различной массой (ядра, оргаиеллы, макромолекулы). p>Применяется для получения чистых фракций различных субклеточных структур для последующего биохимического и биофизического исследований.

Электрофорез.

Движение заряженных частиц (макромолекул и др.), взвешенных в электролите, при наложении внешнего электрического поля; осуществляется в среде пористого наполнителя (хроматографическая бумага, гели); в зависимости от величины и знака заряда частиц они перемещаются к катоду или аноду и занимают совершенно определенное место (зону) (рис. 3.2).

Используется для разделения сложных смесей биополимеров — белков, нуклеиновых кислот и др.

Рентгеноструктурный анализ.

Основан на изучении дифракции, возникающей при взаимодействии рентгеновского излучения с кристаллическим образцом.

Рис. 3.2. Электрофореграмма смеси белков (каждому пятну соответствует определенная белковая фракция)

Применяется для исследования атомно-молекулярного строения биологических полимеров — пептидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

5. Хроматография. Разделение смеси веществ за счет различий в их распределении в системе, состоящей из двух компонентов — подвижного (газовая или жидкая фаза) и неподвижного (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе).

Основные разновидности: жидкостная, газовая, тонкослойная хроматография.

Используется для разделения и анализа смесей веществ, а также изучения их физико-химических свойств (массы и размеров молекул и др.).

Метод электрофореза в молекулярной биологии

Принципы гель-электрофореза

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Читайте также:  Эвиталия комплекс сухих микроорганизмов пробиотиков инструкция

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Как это работает?

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

Трансиллюминатор

После завершения разделения гель окрашивается красителем, чтобы выявить полосы разделения. Бромид этидия представляет собой флуоресцентный краситель, обычно используемый в гелевом электрофорезе. Гель вымачивают в разбавленном растворе бромида этидия и затем помещают на УФ-трансиллюминатор для визуализации разделительных полос.

Полосы сразу проверяются или фотографируются для дальнейшего использования, поскольку они будут диффундировать в гель с течением времени. Краситель также может быть загружен в гель заранее, чтобы отслеживать миграцию молекул, как это происходит.

Применение гель-электрофореза

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях молекулярной биологии и биохимии в таких областях, как судебная медицина, консервативная биология и медицина.

Ниже перечислены некоторые ключевые применения технологии:

  • При отделении фрагментов ДНК для отпечатков пальцев ДНК для расследования преступлений
  • Проанализировать результаты полимеразной цепной реакции
  • Проанализировать гены, связанные с определенной болезнью
  • В профилировании ДНК для проведения таксономических исследований для различения различных видов
  • При тестировании отцовства с использованием отпечатков пальцев ДНК
  • При изучении структуры и функции белков
  • При анализе устойчивости к антибиотикам
  • В методах блоттинга для анализа макромолекул
  • Изучая эволюционные отношения, анализируя генетическое сходство между популяциями или видами

Добавить комментарий Отменить ответ

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Ссылка на основную публикацию
Электрокоагуляция противопоказания, лечение сосудов, реабилитация, фото до и после, цены, отзывы
Электрокоагулятор фото Архив Структура Контроль На приём Поиск Отзывы Удаление новообразований кожиметодом электрокоагуляции Хирургическая коагуляция током высокой частоты широко применяются...
Шум в ушах (тиннутус), симптомы, диагностика, лечение
Шумит, звенит все в голове… О.В. Веселаго кандидат медицинских наук, врач-отоневролог НИИ неврологии РАМН В организме человека постоянно имеются условия...
Шум в ушах и головокружения как признаки поражения внутреннего уха — ПроМедицина Уфа
Головокружение у женщин в возрасте 30–35 лет Женщины в 30 лет еще довольно молоды, полны сил и здоровья. Но в...
Электрокоагуляция родинок, удаление коагулятором, электроножом, отзывы
Электрокоагуляция родинок: 11 преимуществ, фото до и после Начиная с детского возраста и на протяжении всей жизни, на теле человека,...
Adblock detector